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JUEL-3574
Schwarzer, Andreas
Charakterisierung des Komplexes aus Na+/Ca2+ -K+ - Austauscher und cGMP gesteuertem kanal in der Plasmamembran von Stäbchenaussensegmente - biochemische Untersuchungen zur Ultrastruktur Ca2+ - transportierender Proteine in Photorezeptoren von Vertebraten
100 S., 1998

In Photorezeptoren von Vertebraten spielt die intrazelluläre Ca2+-Konzentration eine entscheidende Rolle für die Signaltransduktion und Lichtadaptation. Die Ca2+-Konzentration im Außensegment von Rindersehstäbchen wird durch einen Ca2+-Einstrom durch cGMP- gesteuerte Kanäle und einen auswärtsgerichteten Ca2+-Transport durch Na+/Ca2+-K+- Austauscher bestimmt. Beide Proteine sind in der Plasmamembran der Stäbchenaußensegmente (ROS) lokalisiert.

In dieser Arbeit wurde die Oligomerisierung des Na+/Ca2+-K+-Austauschers und seine Assoziation mit dem cGMP-gesteuerten Kanal in ROS aus der Rinderretina untersucht. Dazu wurde hauptsächlich die Methode der kovalenten Verbrückung benachbarter Proteine mit SH- spezifischen Reagenzien verwendet. Vernetzte und unvernetzte Proteine wurden durch denaturierende SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Western-Blots mit Antikörpern gegen den Na+/Ca2+-K+-Austauscher und gegen die [alpha]- und [beta]-Untereinheit des cGMP- gesteuerten Kanals analysiert.

In der Plasmamembran von ROS konnte der Na+/Ca2+-K+-Austauscher, durch katalytische Oxidation benachbarter Thiole mit Cu2+-phenanthrolin, nahezu vollständig zu einem 490 kDa- Crosslink verbrückt werden. Stabile Vernetzungsprodukte wurden ebenfalls mit dem SH- spezifischen Reagenz N,N'-p-Phenyldimaleimid (PPDM) gebildet. Durch Neuraminidase- behandlung wurde die apparente Molmasse des stark glykosylierten Na+/Ca2+-K+- Austauschers um 50 kDa und die apparente Molmasse des 490 kDa-Crosslinks um 85 kDa reduziert. D,L-l,4-Bismaleimido-2,3-butandiol (BMBD), ein neues SH-spezifisches und spaltbares Vernetzungsreagenz, wurde verwendet, um gespaltene Vernetzungsprodukte in einer zwei-dimensionalen SDS-Gelelektrophorese zu analysieren. Durch Reinigung des BMBD-vernetzten Na+/Ca2+-K+-Austauschers und Analyse der gespaltenen Crosslinks konnten Homodimere des Austauschers identifiziert werden. Höhere Oligomere wurden nicht beobachtet, so daß der Na+/Ca2+-K+-Austauscher sehr wahrscheinlich als Homodimer in der Plasmamembran vorliegt.

Vemetzungsprodukte des Austauschers wurden nach Solubilisierung in 10 mM CHAPS nicht beobachtet. Der in Phosphatidylcholinvesikel rekonstituierte Austauscher konnte dagegen zu einem geringen Prozentsatz wieder verbrückt werden. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, daß das Dimer des Na+/Ca2+-K+-Austauschers in Detergenz dissoziiert ist.

Die a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals kann mit SH-spezifischen Reagenzien nur nach Aktivierung des Kanals mit cGMP verbrückt werden. abwohl der Na+/Ca2+-K+- Austauscher kein cGMP bindet, zeigte er zusätzliche Vernetzungsprodukte mit apparenten Molmassen von 330 kDa, 465 kDa und 545 kDa, wenn der Kanal vor der Verbrückung aktiviert wurde. Diese Crosslinks des Austauschers banden, im Gegensatz zum monomeren Austauscher und den Homodimeren, an eine Calmodulin (CaM)-Agarose-Säule. Da der cGMP-gesteuerte Kanal nahezu das einzige CaM-bindende Protein in der Plasmamembran von Stäbchenaußensegmenten ist, deutet die Bindung des vernetzten Austauschers an die CaM-Säule aufeine kovalente Verbrückung mit dem Kanal hin. In einer zwei-dimensionalen SDS-Gelelektrophorese der gespaltenen Vernetzungsprodukte wurden die a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals und der Na+/Ca2+-K+-Austauscher als Komponenten der 330 kDa-, 465 kDa- und 545 kDa-Crosslinks identifiziert.

Auf einer CaM-Agarosesäule wurde der größte Teil des Austauschers gebunden und mit dem cGMP-gesteuerten Kanal ko-eluiert, wenn RaS-Membranen in 10 mM CHAPS solubilisiert wurden. Der Austauscher band dagegen nicht an die Säule, wenn die Membranen in 18 mM CHAPS solubilisiert wurden. Wurde der Austauscher affinitätschromatographisch gereinigt und so der Kanal entfernt, konnte der Na+/Ca2+-K+-Austauscher ebenfalls nicht mehr an eine CaM-Säule gebunden werden.

Der Austauscher band direkt an die a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals, wenn Western Blots gereinigter Kanalproteine bzw. von RaS-Membranproteinen mit gereinigtem Austauscher inkubiert wurden.

Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß der Na+/Ca2+-K+-Austauscher und die [alpha]-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals in der Plasmamembran von Stäbchenaußensegmenten assoziiert sind.

Alkylierung von SH-Gruppen des aktivierten und des nicht-aktivierten Kanals mit N- Ethylmaleimid (NEM) und anschließende Verbrückung des aktivierten Kanals mit SH- spezifischen Reagenzien deuten darauf hin, daß die a-Untereinheit des Kanals SH-Gruppen besitzt, die im Protein geschützt sind und durch Aktivierung mit cGMP exponiert werden. Ein -130 kDa-Crosslink wurde beobachtet, wenn SH-Gruppen der RaS-Membranproteine mit NEM alkyliert wurden, bevor der Kanal aktiviert und vernetzt wurde. Dieser Crosslink ist sehr wahrscheinlich auf ein Homodimer der a-Untereinheit des cGMP-gesteuerten Kanals zurückzuführen .

Auf der Grundlage der Dimerisierung des Na+/Ca2+-K+-Austauschers und der [alpha]-Untereinheit und der Assoziation zwischen beiden Proteinen, wird ein Modell der ultrastrukturellen Organisation des Komplexes aus caMP-gesteuertem Kanal und Na+/Ca2+-K+-Austauscher vorgeschlagen.

In vertebrate photoreceptors, the intracellular Ca2+ concentration plays a crucial role for signal transduction and light adaptation. In bovine rod outer segments (ROS) intracellular Ca2+ concentration is set by Ca2+ influx through cGMP-gated channels and extrusion of Ca2+ ions by Na+/Ca2+K+ exchangers. Both proteins are localized in the plasma membrane ofthe outer segment.

In this study the oligomeric state ofthe Na+/Ca2+K+ exchanger and its association with the cGMP-gated channel in bovine ROS were investigated, mainly using chemical cross-linking techniques. Proteins were separated by SDS gel electrophoresis and analyzed on Western Blots using antibodies against the Na+/Ca2+K+ exchanger and [alpha]- and [beta]-subunit ofthe cGMP- gated channel.

In the native membrane, virtually all Na+/Ca2+K+ exchanger could be cross-linked mainly to a 490 kDa product by catalysed disulfide formation with cupric-phenanthroline. Stable crosslinks were also obtained with the thiol-specific reagent N,N'-p-phenylenedimaleimide. Neuraminidase treatment of the heavily glycosylated exchanger and of the 490 kDa crosslink reduced the apparent molecular mass by 50 kDa and 85 kDa, respectively. DL-1,4- Bismaleimido-2,3-butanediol (BMBD), a novel SH-specific and cleavable crosslinker, was used to analyse the cleaved crosslinks in two-dimensional SDS gel electrophoresis. Purification of the BMBD cross-linked exchanger and analysis of the cleaved crosslinks identified homodimers ofthe exchanger. Higher oligomers were not detected, suggesting that the Na+/Ca2+K+ exchanger exists as a homodimer in the plasma membrane.

No crosslinks ofthe exchanger were obtained after solubilization in 10 mM CHAPS, but a small percentage of the exchanger was cross-linked, when the exchanger was reconstituted into phosphatidylcholine vesicles. This finding suggests that the exchanger dissociates into monomers, when solubilized in detergent.

SH-specific reagents did not crosslink the a-subunit of the cGMP-gated channel, unless it was activated by cGMP. Although the Na+/Ca2+K+ exchanger did not bind cGMP, it showed additional crosslinks with apparent molecular masses of 330 kDa, 465 kDa and 545 kDa, when the channel was activated before crosslinking. These crosslinks of the exchanger were bound to a calmodulin (CaM)-agarose column, whereas the monomeric exchanger and its homodimers did not bind to CaM-agarose. Since the cGMP-gated channel is the major CaM- binding protein in the plasma membrane of the ROS, binding of the cross-linked exchanger suggests that it was covalently bound to the channel. Two-dimensional SDS gel electrophoresis of the cleaved crosslinks identified the [alpha]-subunit of the cGMP-gated channel and the Na+/Ca2+K+ exchanger as components of the 330 kDa, 465 kDa and 545 kDa cross- links.

On a CaM-agarose column, most of the exchanger was bound and co-eluted with the cGMP-gated channel, if ROS-membranes were solubilized in 10 mM CHAPS, but not if solubilized in 18 mM CHAPS. On the other hand, exchanger did not bind to CaM-agarose, when channel protein was removed by affinity purification.

Na+/Ca2+K+ exchanger bound directly to the [alpha]-subunit of the cGMP-gated channel if Western Blots of purified channel proteins and total ROS membrane proteins were incubated with purified exchanger protein.

Together, these findings suggest that the Na+/Ca2+K+ exchanger and the [alpha]-subunit ofthe cGMP-gated channel are associated in the plasma membrane ofrod outer segments.

Alkylation of SH-groups of the activated and non-activated channel with N- ethylmaleimide (NEM) and subsequent treatment of the activated channel with SH-specific reagents suggests that the [alpha]-subunit contains thiol-groups that were buried within the protein and exposed by activation with cGMP .A -130 kDa crosslink product of the [alpha]-subunit was detected when thiol-groups of ROS membrane proteins were alkylated with NEM before the channel was activated and cross-linked. This crosslink is apparently due to a homodimer of the [alpha]-subunit ofthe cGMP-gated channel.

On the basis ofthe dimerization ofthe Na+/Ca2+K+ exchanger and the [alpha]-subunit and the association between both proteins, a model of the ultrastructural organization of the complex of cGMP-gated channel channel and Na+/Ca2+K+ exchanger is proposed.

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